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        上海精宏

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        培養(yǎng)箱在大豆磷酯微生物限度檢查辦法適用性

        返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-08-05 15:32【

        本試驗的目的是為了確認(rèn)所采用的中國藥典 2015 年版四部和 2015 年版第一增補(bǔ)本四部 中的微生物限度檢查方法適用于大豆磷酯需氧菌進(jìn)行適用性試驗,滿足藥典規(guī)定的檢驗要求。



        1 儀器與材料

        1.1 主要儀器設(shè)備


        隔水式恒溫培養(yǎng)箱;生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器;鼓風(fēng)干燥箱;生物安全柜;電 冰箱。



        1.2 試驗用菌種

        金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌,黑曲霉,大腸埃希菌。 菌種來源均為中國食品藥品檢定研究院,菌種代數(shù)依次為第三代,第三代,第五代,第三代, 第三代,第三代。



        1.3 培養(yǎng)基

        胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基;麥康凱肉 湯培養(yǎng)基,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液。



        1.4 試劑

             吐溫 80。

        1.5 器皿


        器具 錐形瓶;無菌刻度吸管;無菌培養(yǎng)皿;無菌試管;剪刀;接種環(huán);酒精燈。



        2 試驗

        2.1 菌懸液制備方法


        取金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物適量,用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別制成含菌數(shù)約為 103~104 cfu/ml 的菌懸液備用。 取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物,加入 5ml 含 0.05%(ml/ml)吐溫 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白 胨緩沖液,將孢子洗脫,洗脫液經(jīng)滅菌的脫脂棉過濾后,用膠頭滴管吸入至經(jīng)滅菌的試管內(nèi), 用含 0.05%(ml/ml)吐溫 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數(shù)約為 103~ 104 cfu/ml 的菌懸液備用,24 小時內(nèi)使用。 取大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物適量,用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數(shù)約為103~104 cfu/ml 的菌懸液備用。



        2.2 供試液制備方法

        取供試品 10g,加 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml,使供試品分散均勻,制成 1:10 供試液。



        2.3 試驗方法

        2.3.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗(平皿法)


        取上述制備好的 1:10 供試液 9.9ml 5 支,分別加入金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌, 枯草芽孢桿菌,白色念珠菌和黑曲霉 0.1ml(含菌量約為 103~104 cfu/ml),混勻。分別取 1ml 注入無菌平皿中,傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,倒置培養(yǎng)。按平皿傾注法測定其菌落 數(shù),同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。



        2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法

        適用性試驗(平皿法) 取上述制備好的 1:10 供試液 9.9ml 2 支,分別加入白色念珠菌和黑曲霉 0.1ml(含菌 量約為 103~104 cfu/ml),混勻。分別取 1ml 注入無菌平皿中,傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基, 混勻,倒置培養(yǎng)。按平皿傾注法測定其菌落數(shù),同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。



        2.3.3 回收率測定

        試驗組:分別按上述菌落計數(shù)方法進(jìn)行試驗組菌落的計數(shù)。 菌液對照組:以稀釋液代替供試品溶液,按照試驗組的菌落計數(shù)方法試驗。 供試品對照組:按菌落計數(shù)方法,不加試驗菌,測定供試品本底菌落數(shù)。 陰性對照試驗:用刻度吸管吸取稀釋液 1ml 置直徑 90mm 的無菌平皿中,注入 15~20ml 熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,倒置培養(yǎng)。陰性對照試驗應(yīng) 無菌生長。如果陰性對照有菌生長,應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 培養(yǎng)條件:需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗時,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草 芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為30~35℃,培養(yǎng)時間3~5天;白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)溫度為30~35℃, 培養(yǎng)時間 5 天。霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗時,白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)溫度為 20~25℃,培養(yǎng)時間 5 天。結(jié)果見表 1,表 2。 結(jié)果判斷:




        回收率:應(yīng)在 0.5~2 范圍內(nèi)。



        2.3.4 控制菌(大腸埃希菌)檢查法方法

        適用性試驗 試驗組:取 1:10 供試液 10ml,接種到 100ml 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中,加入大腸埃 希菌 1ml,(含菌量為 10~102 cfu/ml),混勻, 30~35℃培養(yǎng) 18 小時,應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陽性對照試驗:取稀釋劑 10ml,接種至 100ml 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中,加入大腸埃 希菌 1ml,(含菌量為 10~102 cfu/ml),混勻, 30~35℃培養(yǎng) 18 小時,應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對照試驗:取稀釋液 10ml 接種至 100ml 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中,混勻, 30~ 35℃培養(yǎng) 18 小時,陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長,應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 選擇和分離培養(yǎng):分別取上述培養(yǎng)物 1ml 接種至 100ml 麥康凱肉湯培養(yǎng)基中,42~44℃ 培養(yǎng) 24 小時。 取麥康凱肉湯培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上, 30~35℃培養(yǎng) 18 小時。 上述試驗組若檢出試驗菌,按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查;若未 檢出試驗菌,應(yīng)消除供試品的抑菌活性并重新進(jìn)行方法適用性試驗。



        2.3.5 以上需氧菌總數(shù)計數(shù)方法

        適用性試驗,霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗和控制 菌檢查方法適用性試驗,分別要進(jìn)行三次試驗。結(jié)果見表 3。




        3 結(jié)論


        由以上對大豆磷酯需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)和控制菌方法適用性試驗可以看 出,按平皿法(1:10)對金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌和黑 曲霉總數(shù)測定的回收率在 0.5~2 范圍內(nèi),確定此法適用于本品需氧菌總數(shù)測定。按平皿法(1: 10)對白色念珠菌和黑曲霉總數(shù)測定的回收率在 0.5~2 范圍內(nèi),確定此法適用于本品霉菌和 酵母菌總數(shù)測定。按常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗,試驗組和陽性對照組菌生長良好,陰性對 照均無菌生長,確定此法適用于本品大腸埃希菌檢驗。


         

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