皮膚是脊椎動(dòng)物最大的器官，具有自我修護(hù)的 能力，在抵御體外侵害過程中起著關(guān)鍵 的 作 用。創(chuàng)傷愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)組織修復(fù)過程， 包括止血、炎癥、細(xì)胞增殖和重塑等一系列復(fù)雜的 過程。在每個(gè)調(diào)控環(huán)節(jié)，干擾影響其創(chuàng)傷修復(fù)的主 要因素包括機(jī)體免疫及巨噬細(xì)胞的活力、氧化應(yīng)激 產(chǎn)生過量過氧化物、血小板的激活、各種因子的釋 放等。目前，常用的創(chuàng)傷修復(fù)藥物主要有基因 工程細(xì)胞因子、抗菌藥物、酶清創(chuàng)制劑、中藥制 劑、抗氧化劑和皮質(zhì)類固醇等。然而，針對(duì)皮 膚外傷的天然無瘢痕制劑及創(chuàng)傷患者專用型臨床營 養(yǎng)品卻非常缺乏，急需開發(fā)有助于創(chuàng)傷愈合的天然 活性物質(zhì)。隨著國內(nèi)外對(duì)海洋來源活性肽功能的深入研究，已發(fā)現(xiàn)部分活性肽在皮膚組織創(chuàng)傷愈合方 面具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值，如海洋膠原蛋白 肽、魚皮膠原蛋白肽等，而貝類來源的活性 肽物質(zhì)目前尚未見在創(chuàng)傷愈合領(lǐng)域的報(bào)道。

馬氏珠母貝 Pinctada martensii 又稱合浦珠母 貝，是中國南方沿海地區(qū)培育珍珠的主要貝種。 隨著人工海水珍珠養(yǎng)殖面積的增多，馬氏珠母貝產(chǎn) 量日益遞增，是南海主要的漁業(yè)資源之一。養(yǎng)殖珍 珠貝主要用于珍珠的采集，珍珠貝肉作為珍珠副產(chǎn) 品，其利用程度低，主要用作鮮食或簡單加工成動(dòng) 物飼料，產(chǎn)值低且易對(duì)環(huán)境造成污染。因此，髙值 化利用是提高馬氏珍珠貝產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)附加值的重要手 段。珍珠貝外套膜作為實(shí)施人工 “插核手術(shù)”的組織小片，具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖和組織修復(fù)能力，并 最終形成珍珠袋，在珍珠形成和免疫抗炎中起著重 要的作用。研究表明，珍珠貝外套膜主要營養(yǎng) 成分是蛋白質(zhì)，主要為膠原蛋白。膠原蛋白作 為細(xì)胞外基質(zhì)重要組成成分之一，對(duì)多種細(xì)胞的生 理功能具有促進(jìn)作用，并誘導(dǎo)多種生長因子的產(chǎn) 生，有利于傷口愈合。因此，本研究中采用酶 法制備馬氏珠母貝外套膜酶解產(chǎn)物 ( enzymatic hydrolysis from mantle of pearl oyster，EHM) ，并探討 了其促進(jìn)小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合作用，以期為進(jìn) 一步利用馬氏珠母貝外套膜開發(fā)皮膚組織創(chuàng)傷愈合 功能的產(chǎn)品和深入研究其機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。

試驗(yàn)用馬氏珍珠貝肉于 2018 年 6 月采自廣東 省湛江市雷州市流沙養(yǎng)殖場，取其外套膜。 試驗(yàn)試劑: 初元Ⅰ型產(chǎn)品 ( 主要成分為小麥 低聚肽、海洋魚皮膠原低聚肽) ，購自江中集團(tuán)股 份有限公司; SPF 級(jí) KM 小鼠體質(zhì)量為 ( 20±2) g， 雄性，購于山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公 司; 中性蛋白酶 ( 30 000 U/g) 購自廣西南寧龐博 生物工程有限公司; 白介素－6 ( interleukin 6，IL－ 6) 、白介素－10 ( interleukin 10，IL－10) 、轉(zhuǎn)化生 長因子 β ( transforming growth factor－β，TGF－β) 、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 ( fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF － 2 ) 、 表皮細(xì)胞生長因子 ( epidermal Growth Factor，EGF) 、細(xì)胞生長周期素 1 ( cyclin D1，CCND1) 和羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建 成生物工程研究所。 試驗(yàn)儀器: Lynx 6000 型高速冷凍離心機(jī)、多 功能酶標(biāo)儀購自 Thermo 公司; BSA224S－CW 型萬 分之一電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器 ( 北京) 有限公司; FE28 型 pH 計(jì)購自梅特勒－托利多儀器 ( 上海) 有限公司; DF－101T 集熱氏恒溫加熱磁力 攪拌器購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司; FDU － 1110 型冷凍干燥機(jī)購自上海愛朗儀器有限公司; SW－CJ－2FD 型雙人超級(jí)操作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備 有限公司。

參照前期團(tuán)隊(duì)的酶解工藝 制備 EHM。采 用 凱 氏 定 氮 法、甲 醛 滴 定 法、雙縮脲法分別測定蛋白質(zhì)含量、水解度和肽含量。

將小鼠按體質(zhì) 量隨機(jī)分為 5 組，每組 20 只，分別為陰性對(duì)照組 ( 生理鹽水，劑量為 0. 1 mL /10 g 體質(zhì)量) 、初元Ⅰ 型產(chǎn)品陽性對(duì)照組及 EHM 低 ( 0. 25 g /kg 體 質(zhì) 量) 、中 ( 0. 5 g /kg 體質(zhì)量) 、高 ( 1 g /kg 體質(zhì)量) 劑量給藥組。將小鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉后， 背部剃毛、消毒，在小鼠背部剪去直徑約 0. 8 cm 的全層皮膚，造成全皮層創(chuàng)傷動(dòng)物模型。小鼠均單 獨(dú)分籠飼養(yǎng)，每天灌胃給藥，每兩天對(duì)創(chuàng)傷口面觀 察、拍照，測量傷口大小，并記錄結(jié)果。每組試驗(yàn) 設(shè) 3 個(gè)平行。

每隔兩天用游標(biāo)卡 尺測量創(chuàng)面直徑 ( cm) 大小一次，計(jì)算創(chuàng)傷愈合率:

創(chuàng)傷愈合率= ( 第 0 天創(chuàng)面直徑－第 n 天創(chuàng) 面直徑) /第 0 天創(chuàng)面直徑×100%。
 

第 14 天時(shí)測量瘢痕長度 ( cm) ，計(jì)算瘢痕縮小率:

小鼠創(chuàng)面組織 勻漿液制備參照趙秉江的方法，分裝后保存于 超低溫 冰 箱 ( － 80 ℃ ) 中 待 測。IL － 6、IL － 10、 TGF－β、FGF－2、EGF、CCND1 和羥脯氨酸含量的 檢測均按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ( mean ±S. D. ) 表示，采用 SPSS 20 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采 用 LSD 法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為 0. 05，極顯著性水平設(shè)為 0. 01。

制備 EHM 時(shí)，選用中性蛋白酶酶解，加酶量 為 1000 U/g ( 原料) 蛋白，溫度為 50 ℃，酶解時(shí) 間為 5 h，該條件下水解度為 23. 4%，制得的 EHM 凍干粉蛋白質(zhì)含量為 55. 66 g /100 g，其中，肽含 量占蛋白質(zhì)含量的 21. 56%。

造模后 第 2 天，各試驗(yàn)組動(dòng)物創(chuàng)面皆已結(jié)痂，傷口周圍出 現(xiàn)紅腫，無液體滲出，傷口收縮均不明顯; 第 4、6、8 天時(shí)，各組創(chuàng)面結(jié)痂不斷變硬，創(chuàng)傷周圍表 面不平整，創(chuàng)緣皮膚收縮明顯，其中，各給藥組結(jié) 痂厚度優(yōu)于對(duì)照組，創(chuàng)面完全封閉，呈現(xiàn)黑紅色; 第 10 天時(shí)，兩對(duì)照組傷口結(jié)痂部分脫落，但瘢痕 面積變化小，各給藥組小鼠傷口明顯縮小，并開始 部分脫痂、縮痂明顯; 第 12 天時(shí)，各組皆已掉痂，愈合處開始長出毛發(fā)，各給藥組進(jìn)一步縮痂，中、 高劑量組二次結(jié)痂; 第 14 天時(shí)，陰性對(duì)照組多數(shù) 傷口小于 2 mm，陽性對(duì)照組和各劑量組傷口直徑 均小于 1 mm，低劑量組呈現(xiàn)肉紅色新生皮膚，新 生肉色組織完整?？傮w來看，低、高劑量組較對(duì)照 組愈合情況良好，無增生性瘢痕及瘢痕疙瘩生成。

創(chuàng)傷愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)組織修復(fù)過程，包括 3 個(gè)/4 個(gè)重疊階段: 止血/炎癥、細(xì)胞增殖和重塑。 本研究中初步探討了珍珠貝外套膜酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠 皮膚創(chuàng)傷愈合的影響，并以愈合階段特征為切入 點(diǎn)，測定各階段試驗(yàn)動(dòng)物皮膚組織相關(guān)生化指標(biāo)， 進(jìn)一步探討了其促進(jìn)傷口愈合的可能作用機(jī)制，為 開發(fā)術(shù)后臨床營養(yǎng)支持和防治創(chuàng)傷愈合不良的產(chǎn)品 提供重要科學(xué)依據(jù)。Pastar 等研究表明，IL － 6 由 M1 型巨噬細(xì) 胞分泌，屬于促炎癥因子; IL－10 由 M2 型巨噬細(xì) 胞分泌，屬于抑制炎癥因子。Du 等研究表明， 第 3、5 天是炎癥反應(yīng)階段，IL－6 含量在損傷后 1 d 顯著增加，在第 3 天時(shí)達(dá)到峰值，第 7 天時(shí) IL－6 含量減低。本研究結(jié)果表明，不同劑量的 EHM 對(duì) 創(chuàng)傷皮膚組織中 IL－6 含量的影響不顯著; 第 3 天 時(shí)，各給藥組創(chuàng)傷模型動(dòng)物皮膚組織中 IL－10 含量 極顯著高于陰性對(duì)照組，同時(shí)，隨時(shí)間延長含量降 低，這與張慧等報(bào)道的 IL－10 含量在第 3 天時(shí) 達(dá)到高峰期，之后開始下降的研究結(jié)果一致。Du 等研究表明，通過減少促炎 M1 巨噬細(xì)胞極化 和促進(jìn)抗炎 M2 極化可減輕炎癥。本研究中陽性對(duì) 照組 ( 初元Ⅰ型產(chǎn)品) 配方中的海洋魚皮膠原低 聚肽、酪蛋白磷酸肽具有抑制炎癥功效，與試驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)，EHM 有較高含量的蛋白及 肽，這有利于 EHM 促進(jìn) IL－10 分泌，從而起到抑 制炎癥反應(yīng)的作用。